- Люминесценция
- (лат. lumen, luminis свет) — «холодное» свечение некоторых веществ (люминофоров)
Различают два вида люминесценции — флюоресценцию (кратковременную люминесценцию ) и фосфоресценцию (длительную люминесценцию ), последняя в физиологических условиях практически не наблюдается. Физические механизмы люминесценции схематически отображены на рис. 1.
В лабораторной практике большое значение имеет исследование спектров люминесценции , которые представляют собой широкие полосы с полушириной (ширина на половине высоты) 50—100 нм. Они сдвинуты в более длинноволновую область по сравнению со спектром поглощения. Причем спектр фосфоресценции сдвинут сильнее спектра флюоресценции (рис. 2).
Для идентификации люминесцирующего вещества измеряются спектры люминесценции и спектры возбуждения люминесценции . Для регистрации спектров люминесценции фиксируют длину волны возбуждающего света и измеряют зависимость l от длины волны излучаемого света. Важнейшими характеристиками являются положение максимума и форма спектра люминесценции (рис. 3). При регистрации спектров возбуждения люминесценции не меняют длину волны регистрируемой люминесценции , но изменяют длину волны возбуждающего света.
Люминесценция биологических объектов может быть собственной (первичной) либо возникать после соответствующей химической модификации имеющихся веществ (вторичная люминесценция ), а также после введения так называемых флюоресцентных зондов. В качестве таких зондов выбирают вещества, параметры люминесценции которых резко меняются в зависимости от характеристики окружающей их среды: полярности, вязкости, поверхностного заряда и др. Часто в качестве зондов используют молекулы, которые в воде почти не флюоресцируют, но при связывании с биологическими мембранами, белками и липидами интенсивность их люминесценции возрастает в десятки раз.
Флюоресцирующие соединения могут быть определены в очень низких концентрациях, часто в присутствии посторонних веществ. Поэтому регистрация люминесценции успешно используется для количественного определения многих биологически важных веществ. Одним из наиболее ярко флюоресцирующих лекарственных соединений является хинин. В кислых растворах он люминесцирует в синей области (450—475 нм). Чтобы определить его в плазме крови проводят осаждение белков метафосфорной кислотой и измеряют люминесценцию хинина прямо в фильтрате. Яркой синей флюоресценцией обладает противогрибковый препарат гризеофульвин, он легко определяется в экстрактах из крови или мочи. Барбитураты в щелочной среде обладают яркой зеленой флюоресценцией, их можно определить в экстрактах из биологического материала. После экстракции возможна количественная регистрация многих витаминов, например витамина Е, максимум флюоресценции которого лежит в УФ-области при 330 нм. Витамин В6 имеет синюю, а витамин А — зеленую флюоресценцию. Витамины С, D, В12 и др. удается определить по вторичной люминесценции.
Наркотические вещества морфин и героин флюоресцируют очень слабо, но после обработки образцов серной кислотой с последующим выщелачиванием возникает специфическая интенсивная синяя флюоресценция продуктов реакции. Этим методом удается определить до 0,02 мкг наркотика в пробе.
Весьма серьезную проблему представляет анализ содержания онкогенных углеводородов в атмосферном воздухе. Загрязнение воздуха улавливают органическими растворителями, затем по сине-зеленой флюоресценции в пентане или концентрированной серной кислоте с высокой чувствительностью (до 0,001 мкг/мл) и специфичностью определяются бензпирен и другие онкогенные вещества.
Чувствительным лабораторным методом определения АТФ является регистрация хемилюминесценции в присутствии люциферина и люциферазы светлячка. Люцифераза катализирует реакцию восстановленного люциферина с АТФ; продукт этой реакции — аденилат при окислении испускает свет.
По собственной люминесценции проводят контроль качества пищевых продуктов. Так, при длительном хранении молока и сливок рибофлавин окисляется в люмихром, что сопровождается изменением цвета флюоресценции от желто-зеленого к синему. Яйца, зараженные некоторыми видами бактерий рода Pseudomonas, при УФ-облучении начинают интенсивно флюоресцировать (за счет пигмента пиовердина, синтезированного этими бактериями).
Регистрацию люминесценции используют в целях диагностики. Характерная первичная люминесценция желто-зеленого цвета, возбуждаемая УФ-облучением при 365 нм, наблюдается в волосах, пораженных паразитическими грибками.
Диагностические возможности существенно расширяются за счет применения флюоресцентных зондов. При введении в организм некоторых гидрофобных порфиринов (гематопорфирина и его производных) эти соединения избирательно накапливаются в опухолевой ткани. Под действием возбуждающего порфирины света наблюдается красная флюоресценция опухолей. Это явление используется для визуального распознавания опухолей кожи, а с помощью эндоскопической техники — опухолей трахеи, бронхов, желудочно-кишечного тракта и др. Свойством накапливаться в опухолях обладает также тетрациклин, флюоресценция которого в опухоли в несколько раз выше, чем в окружающих ее тканях. Эту особенность используют в ряде случаев для того, чтобы отличить опухолевое поражение желудка от воспалительного или язвенного, при которых подобного роста флюоресценции не наблюдается.
Если в локтевую вену человека ввести несколько миллилитров раствора флюоресцеина, то через несколько секунд ярко-зеленую флюоресценцию можно наблюдать в тканях глаза, слизистой оболочке рта и на губах. Данный метод можно использовать, например. для определения скорости кровотока.
Явление люминесценции широко используется в ряде микроскопических методов исследования. Некоторые примеры применения люминесцентной микроскопии показаны на рис. 4—5.
В диагностической и санитарно-гигиенической практике находит применение регистрация хемилюминесценции, сопровождающей процессы пероксидного окисления липидов биологических мембран, а также генерацию активных форм кислорода фагоцитирующими клетками.
Регистрация люминесценции позволяет получать важную информацию о физико-химических свойствах биологических объектов в норме и патологии. Молекулярные механизмы работы цепи переноса электронов в митохондриях, целых клетках и даже в тканях изучают по изменению синей (440 нм) флюоресценции восстановленных пиридиннуклеотидов, возбуждаемой при 365 нм. При изучении структуры нуклеиновых кислот применяют акридиновый оранжевый и другие зонды. При этом определение положения максимума люминесценции в спектре позволяет судить о структуре нуклеиновой кислоты. Так, максимум люминесценции акридинового оранжевого и двуспиральной нативной ДНК располагается в зеленой области спектра (530 нм), тогда как в одноцепочечной ДНК и РНК он смещается в красную область (640 нм). Микрофлюориметрически с помощью зондов анализируют ДНК непосредственно в клетках.
В медицинской технике распространение получили неорганические люминофоры — вещества, способные к фото-, рентгенофлюоресценции и т.д. Люминофоры используются в люминесцентных лампах. При изготовлении рентгеновских экранов применяют цинккадмийсульфидные люминофоры, способные к рентгенолюминесценции.
См. также Фотобиологические процессы.
Библиогр.: Владимиров Ю.А. и Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах, М., 1972; Владимиров Ю.А. и Потапенко А.Я. Физико-химические основы фотобиологических процессов, с. 27, М., 1989; Гительзон И.И. и др. Светящиеся бактерии, Новосибирск, 1984; Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеинов, М., 1989: Зеленин А.В. Люминесцентная цитохимия нуклеиновых кислот, М., 1967, библиогр.; Карнаухов В.Н. Люминесцентный спектральный анализ клетки, М., 1978, библиогр.; Конев С. В и Волотовский И.Д. Фотобиология, Минск, 1979; Лакович Дж. Основы флуоресцентной спектроскопии, пер. с англ., М., 1986; Паркер С. Фотолюминесценция растворов, пер. с англ. М., 1972; Юденфренд С. Флуоресцентный анализ в биологии и медицине, пер. с англ., М., 1965.
